Holt đã làm việc 19 năm với CBS, trong vai trò làm phóng viên, người dẫn và cộng tác viên quốc tế.

Năm 1981, ông được tuyển vào làm phóng viên cho đài WCBS-TV ở Thành phố New York. Năm 1982, ông trở thành phòng viên và người dẫn cuối tuần trên sóng đài KNXT ở Los Angeles, và sau đó một năm quay trở lại vai trò phóng viên và người dẫn cuối tuần tại WCBS-TV. Sang năm 1986, Holt chuyển sang làm tại WBBM-TV ở Chicago, nơi ông làm người dẫn bản tin tối suốt 14 năm. Holt không chỉ làm việc trên bàn dẫn mà còn đưa tin rộng khắp các vùng trên thế giới bao gồm Iraq, Bắc Ireland, Somalia, El Salvador và Haiti.[14]

Holt gia nhập MSNBC vào năm 2000. Năm 2003, ông bắt đầu làm việc toàn thời gian tại NBC News, trở thành người dẫn thay thế cho NBC Nightly News và Today. Holt trở thành người dẫn toàn thời gian của Weekend Today sau khi người đồng dẫn trước đó là David Bloom qua đời.[16] Tới cuối năm 2005, ông cũng dẫn một bản tin hai giờ đồng hồ hằng ngày trên MSNBC. Vào ngày 9 tháng 5 năm 2007, Holt trở thành người dẫn cho phiên bản cuối tuần của NBC Nightly News trong vòng 8 năm trước khi chính thức trở thành người dẫn cố định hằng ngày.[17] Ngoài ra, Holt còn là người dẫn hiện tại cho chương trình Dateline của NBC. Ông là người dẫn trong các buổi tranh luận tổng thống năm 2016, và đã từng phỏng vấn Tổng thống Donald Trump vào năm 2017, mà theo đồng nghiệp nói thì các câu hỏi của ông hóc búa nhưng hoàn toàn phù hợp.

Ngoài công việc chính của mình tại NBC News, ông còn dẫn một chương trình đặc biệt của The History Channel về các thuyết âm mưu về sự kiện 11 tháng 9, làm phóng viên cho NBC Sports trong buổi tường thuật Thế vận hội mùa hè 2008,[18] và cũng là người dẫn của Dateline on ID, một tập chương trình Dateline NBC được chiếu trên mạng lưới Investigation Discovery.[19] Năm 2008, ông là người thể hiện lời bình trong một bộ phim tài liệu về những bộ hộp sọ pha lê trên kênh Sci-Fi Channel.

Khi Brian Williams nghỉ dẫn vào năm 2013 để phẫu thuật thay thế đầu gối, Holt được chỉ định làm người dẫn thay thế vào cuối tuần. Năm 2015, Williams bị đình chỉ do phóng đại một câu chuyện về cuộc Chiến tranh Iraq, và Holt chính thức thay thế ông làm người dẫn cho NBC Nightly News.[5][20][21]

Holt đã dẫn cuộc tranh luận các ứng viên tổng thống Đảng Dân chủ vào tháng 1 năm 2016 cùng với một nhóm các phóng viên chính trị của NBC,[22] cũng như cuộc tranh luận tổng thống đầu tiên vào ngày 26 tháng 9 năm 2016.[23] Ứng viên tổng thống Donald Trump cho rằng đây là "một hệ thống rất bất công" vì "Lester là một đảng viên Dân chủ". Holt thực chất là đảng viên Đảng Cộng hòa.[24] Sau buổi tranh luận, Trump cho biết Holt đã làm tốt công việc. Các nhà báo cũng đồng ý về vai trò của Holt, ví dụ như khi ông đã phản kháng lại Trump khi ông ta nói rằng ban đầu ông phản đối cuộc chiến tại Iraq.[25][26] The Washington Post cho rằng "Nhờ có Holt đã làm sáng tỏ rằng hành động "kiểm tra đột xuất" (stop-and-frisk) được định rõ là vi hiến tại New York, khi mà Trump cho rằng không phải như thế.[27]

Vào tháng 5 năm 2017, Holt phỏng vấn Tổng thống Trump. Cả hai đã bàn luận về việc ông Trump sa thải giám đốc FBI James Comey. Trump ban đầu cho biết ông sa thải Comey vì kết luận của ông ta với cuộc điều tra bê bối thư điện tử của Hillary Clinton. Các nhà phê bình thì cho rằng Trump sa thải Comey vì cuộc điều tra của Comey vào việc nhân viên của Trump liên lạc với nước Nga. Tuy nhiên, Trump nói với Holt rằng: "Khi tôi quyết định [sa thải Comey], tôi tự nói với mình rằng: 'Anh biết đấy, cái chuyện về Trump và nước Nga này hoàn toàn là bịa đặt.'"[28]

Cuộc phỏng vấn của Holt với Trump được truyền thông chú ý rất nhiều. Người dẫn tin tức trên truyền hình Lawrence O'Donnell nói: "Cuộc phỏng vấn của Lester Holt có lẽ là cuộc phỏng vấn trên truyền hình quan trọng nhất từng được thực hiện," và rằng có lẽ chỉ sau cuộc phỏng vấn của David Frost với Richard Nixon. O'Donnell thấy rằng đây là bằng chứng của sự che giấu bất hợp pháp cho vụ bê bối với nước Nga. "Đây là ông ta nói rằng, 'Tôi đang nghĩ về vụ điều tra với Nga, nói cách khác là tôi đang nghĩ về Michael Flynn, lúc tôi sa thải James Comey.'"[29][30]

Khác

Holt cũng từng là diễn viên khách mời trong bộ phim năm 1993 The Fugitive cùng phần sau vào năm 1998, U.S. Marshals; và Primal Fear (1996); cũng như các chương trình truyền hình như tập "Red, White, or Blue" của series Due South, "Fate" của Early Edition và "A New Hope" của Warehouse 13. Ông còn xuất hiện trên tập "Cleveland" trong chương trình hài kịch tình huống 30 Rock của NBC. Ông cũng tham gia trong tập "Sandwich Day", trong đó công bố Jack Donaghy sẽ trở thành thành viên nội các mới trong chính quyền của Tổng thống Bush. Holt từng tham gia chương trình Westminster Kennel Club Dog Show vào các năm 2006, 2007 và 2008 của USA Network và cũng xuất hiện trên tạp chí Making Music.